اختبارالكشف عن تلوث المياه بمياه المجاري
واختبار المياه للتلوث بمياة المجاري ( ووجود ميكروبات القولون ) يجري في العاده علي 3 خطوات هي:
1
الاختيار الاحتمالي
2
الاختيار التحقيقي
3
الاختيار التكميلي
اولا : الاختبار الاحتمالي
لاختيار وجود مجموعة ميكروبات القولون يجري ذلك الاختبار بتقيح بويون اللاكتوز أو بيئة ماكونكي السائلة بعينه المياه المطلوب فحصها فإذا تكون حامض وغاز حوالي 10% أو أكثر من حجم أنبوبة درهام في خلال 24 ساعة فان هذا الاختبار ( الاحتمالي ) يكون موجبا ، أما إذا تكون حامض و غاز في هذه البيئة بعد 24 ساعة أخري فان نتيجة الاختبار يكون مشكوكا فيها وعلي ذلك تجري الاختبارات الاخري ، اما عدم وجود الغاز و الحامض بعد 48 ساعة فيؤخذ ذلك دليلا علي ان الماء غير ملوث وصالحا للشرب ولا داعي لإجراء أي اختبارات أخري. ولاجراء الاختبار الاحتمالي تتبع الخطوات الاتيــة.
· - الادوات و البيئات اللازمــة .
1-
عينة المياه.
2-
25 انبوبة اختبار تحتوي كل منها علي 9 مل من بيئة بويون اللاكتوز المحتوية علي دليل بروم ثيمول بلو وأنبوبة درهام أو بيئة ماكونكي السائلة.
3-
ماصات 1سم معقمــة.
4-
ماصات 10 سم معقمــة.

· خطوات العمل :-
1-
رج عينة المياه جيداً حوالي 25 مره
2-
انقل بواسطـة ماصة معقــمــة مقدار1مل من عينة الماء إلي انبوبة بها 9 مل ماء معقم فيصبح التخفيف 10-1
3-
استمر في عمل سلسلة التخفيفات حتى التخفبف 10-5 مع ملاحظــة كتابة ارقام التخفيفات علي الأنابيب مع استعمال ماصـه واحدة لكل تخفيف بشرط أن تكون معقمــة.
4-
لقح كل من كل تخفيف 5 أنابيب محتوية علي بيئة ماكونكي السائلة ( كل منها يحتوي علي 9 مل بيئة ) بمقدار 1 مل من التخفيف الخاص بها.
5-
حضن جميع الانابيب ( 25 انبوبة ملقحة ) علي 37 °م لمدة 24 ساعة.
6-
اختبر الانابيب لوجود حامضي (تغير لون البيئة من البنفسجي او القرمزي الى اللون الاصفر) وغاز (بنسبة 10% من انبوبة درهام ) بعد 24 ساعة فإذا لم يتكون غاز حضن لمدة 24 ساعة أخري و لاحظ نتيجة وجود الغاز من عدمــه بعد كل مده (24 ساعه، 48 ساعه ).
7-
إذا لم تتكون غاز بعد 48 ساعة تعتبر النتيجــه سلبيه ، ولاتجري الاختبارات التالية.
ويجدر بالذكر أن عينات المياه التي تعطي نتيجة ايجابية في الاختبار الاحتمال . لاتعني ضرورة وجود ميكروبات القولون بها، فقد يتكون الحامض والغاز لاسباب اخري منها.
1- وجود بكتريا لاهوائية محللة لسكر اللاكتوز مثل وجود انواع من Clostridium مع بعض البكتريا الهوائية.
2- وجود بكتريا متجرثمــة . لها القدرة علي تحليل سكر اللاكتوز مع انتاج حامض وغاز ، مثل Bacillus
3- ظاهرة التنشيط ( التآزر ) وفيها يحلل أحد الميكروبات سكر اللاكتوز ، وينتج حامضا ومركبات وسطيـة . بينما يوجد ميكروب آخر يحلل بعض تلك المركبات الوسطيـة ، وينتج غاز ، مثل وجود ميكروبي .. الذي ينتج الحامض و ... الذي ينتج الغاز ويلاحظ أن الغاز لايتكون . الإعند وجود الميكروبين معا بالوسط.
· النتائج و الحسابات.
التخفيف
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
النتيجه الموجبة
5
5
3
2
1

*- يتم تحديد P1 = اقل تخفيف يعطي اعلى نتيجة موجبة , يليها P2 و P3
اعداد ميكروبات القولون في 1 مل عينة مياه = قيمة P الجدولية χ مقلوب التخفيف الاوسط ( تخفيف P2 ).
قيمة P الجدولية = يتم استخراجها من جدول كوكرن
ثانيا : الاختبار التحقيقي
إذا كان الاختبار الاحتمالي السابق الذكر مشكوكا فيه بمعني ظهور أي كميه من الغاز بعد 48 ساعة من التحضين فيجب إجراء الاختبار التحقيقي.
يستعمل عادة أحدي بيئتين في الاختبار التحقيقي وهما:.
1- بيئة الEosein methylen blue ويرمز لها E.M.B
2- بيئة ال Endo agar
ويلاحظ الاتي:.
1- مجاميع تظهر علي بيئة ال E.M.B ذات مركز أسود ولمعان معدني مخضر ( تشبه الكوبيا ) وهذه هي مجاميع ال E.coli بينما تظهر مجاميع ال Enterobacter aerogenus علي هذه البيئة بنيــة المركز وخالية من اللمعان.
2- إذا استعملت بيئة ال Endo agar فتظهر مجاميع ال E.coli ذات مركز غامق وتتلون البيئة حولها بلون أحمر غامق وقد يكون أو لايكون لها لمعان معدني أما مجاميع ال Enterobacter aerogenus فلا يظهر لها المركز الغامق وتكون معتمــه وردية اللون.
· الادوات و البيئات اللازمــة :.
1-
أطباق بتري تحتوي علي بيئة الEosein methylen blue
2-
أنابيب بيئة ماكونكي السائلة التي أظهرت اختبار احتماليا مشكوكا فيه

· بيئة ال Eosein methylen blue
تحضر هذه البيئة باضافة كميــة معلومة من سكر اللاكتوز مع الصبغتين الEosein و methylen blue والاجار المغذي ثم يصب المخلوط بعد ضبط ال PH و التعقيم في أطباق بتري معقمة و تترك حتى تتصلب ثم يتم التخطيط عليها من انابيب بيئة ماكونكي السائلة المشكوك فيها .
· يعتمد لون المجاميع التي تظهر علي هذه البيئة علي عاملين هما.
1- تفاعل الايوسين ( وهي صبغــة حامضة ) مع الميثلين الازرق وهي ( صبغة قاعدية ) لتكون صبغة مركبة لها خواص متعادلة.
2- تكوين كمية من الأحماض نتيجة لتخمر اللاكتوز من شأنها خفض الرقم الايدروجيني ( PH ) مسببا امتصاص الصبغة المركبة علي الخلايا المكونة للمجموعة.
ويلاحظ أن الميكروبات التي لاتخمر اللاكتوز غالبا ما تكون شفافة ( لا لون لها ) إذ ان الصبغة المركبة لا تؤخذ علي الخلايا في وسط قلوي بينما تظهر البيئة بلون احمر .
· بيئة ال Endo agar
تحضر هذه البيئة باضافة لاكتوز ، فوكسين قاعدة ( سبق أزالة اللون منه بواسطــة إضافة كبريتيت الصوديوم إلي بيئة الاجار المغذي المنصهر ثم صب المخلوط بعد ضبط ال PH و التعقيم في أطباق بتري معقمة
ويعتقد ان ال...... يعمل كبيئة تحجز الاستيلدهيد وهي المادة المسئولة عن التفاعل ، فهذة المادة عبارة عن مركب وسطي ينتج عن تخمير اللاكتوز وتكون مركبا مع كبرتيت الصوديوم ثم يتحلل هذا المركب وينشأ عن ذلك ظهور لون أحمر في منطقة المجاميع المنتجة للاستيلدهيد.
أما المجاميع التي لا تحلل اللاكتوز تظهر لا لون لها بينما تظهر البيئة بلون وردي خفيف.

· خطوات العمل :-
1-
قم بصب كل من بيئتي الايوسين ميثيلين بلو والاندو اجار في اطباق بتري معقمة.
2-
لقح الاطباق من أنبوبة بويون اللاكتوز التي أظهرت اختباراً احتماليا مشكوكا فيه وذلك بطريقة التخطيط.
3-
اقلب الاطباق وحضن علي 37م لمدة 24 ساعة.
4-
بعد فترة التحضين أختبر المجاميع ودون النتائج في جدول مع مقارنة مجاميع الميكروبات التي تظهر على البيئات



لاحظ المستعمرات المنفردة بعد النمو

ثالثا: الاختبار التكميلي
يجري الاختبار التكميلي عادة للتأكد من أن المجاميع التي ظهرت علي الاطباق في الاختبار السابق تتبع مجموعة القولون ويشمل :.
1- ان الميكروب المعزل من الاختبار الاحتمالي الايجابي يستطيع أن يخمر اللاكتوز ثانية.
2- أن المجاميع النامية علي البيئتين السابقتين والتي تظهر تحت الميكروسكوب عند فحصها بطريقة جرام : خلايا عصوية قصيرة سالبة لصبغة جرام غير متجرثمة وأنها تتبع مجموعة القولون.
الأدوات و البيئات اللازمــة :
1-
اطباق التخطيط الناتجة من الاختبار التحقيقي والتي ظهرت عليه مجاميع حقيقية وغير حقيقية لمجموعة القولون .
2-
3 انابيب من بيئة ماكونكي السائلة.
3-
آجار مغذي مائل.
4-
شرائح نظيفة.
5-
صبغة جرام .

· خطوات العمل :-
1-
خذ بواسطــة أبرة معقمـة جزءا من كل من مجاميع الكوليفورم النامية عل كل من البيئتين السابقتين ولقح بها أنابيب بيئة ماكونكي السائلة ، وكذلك أنبوبة آجار مائل.
2-
ضع الأنابيب في المحضن علي 37 م
3-
بعد 24 ساعة أعمل غشاء من الاجار المائل وأصبغة بطريقة جرام وافحص الميكروب
( خلايا عصوية قصيرة سالبة لصبغة جرام غير متجرثمـة )
4-
بعد 48 ساعة اختبر أنابيب بيئة ماكونكي السائلة لوجود حامض وغاز.